Quando pesquisas do mal produzem resultados do bem

Por permitir o estudo rápido e automatizado das moléculas, os microarrays são normalmente incluídos na categoria dos biochips - plataformas construídas com a mesma tecnologia dos processadores de computador, voltadas para estudos biológicos.
[Imagem: Wikimedia/Johns Hopkins]

Guerra biológica

Os pesados investimentos feitos em pesquisas relacionadas à biodefesa após os ataques terroristas de 11 de setembro de 2001, nos Estados Unidos, geraram muitas críticas ao governo norte-americano, devido ao suposto redirecionamento de verbas destinadas à pesquisa em geral para esse fim específico.

Como em todos os campos que se intitulam "de defesa", é quase impossível discernir entre o que é de fato defesa e o que é ataque - por exemplo, no jargão militar, um ataque voltado a evitar que o inimigo se organize enquadra-se na categoria de defesa.

Embora um ataque bioterrorista, felizmente, não tenha se tornado realidade, o esforço científico feito com esses recursos pode ter gerado um retorno inesperado, ao viabilizar avanços metodológicos que poderão ser usados para o desenvolvimento de novas vacinas contra quaisquer patógenos, sejam de interesse para biodefesa ou não.

Fibrose cística

Um grupo de pesquisadores daquele país, que contou com a participação de um cientista brasileiro, utilizou plataformas originalmente desenvolvidas para fins de biodefesa e identificou, na bactéria Pseudomonas aeruginosa - responsável por infecção pulmonar crônica em portadores de fibrose cística -, dezenas de proteínas capazes de desencadear resposta imunológica adaptativa em pacientes infectados, sendo que ainda não existe uma vacina efetiva que proteja dessa infecção.

O estudo, publicado na edição de novembro da Infection and Immunity, aponta candidatos potenciais para o aprimoramento de testes diagnósticos e para o desenvolvimento de vacinas.

Chips biológicos

De acordo com o principal autor do trabalho, o brasileiro Wagner Montor, o estudo foi possível graças à utilização de uma plataforma inovadora desenvolvida com recursos investidos principalmente em biodefesa: o Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA).

O NAPPA sintetiza as proteínas a partir dos seus próprios moldes de DNA, por isto sendo chamado também de estudo de proteínas sem células. A técnica permite a análise rápida de interações proteína-proteína e das interações entre as proteínas e outras moléculas celulares, como lipídios e DNA.

Array é uma espécie de ordenador, uma pequena placa de vidro com perfurações perfeitamente espaçadas onde são afixadas as proteínas ou moléculas que se deseja estudar. Por permitir o estudo rápido e automatizado das moléculas, os arrays são normalmente incluídos na categoria dos biochips - plataformas construídas com a mesma tecnologia dos processadores de computador, voltadas para estudos biológicos.

Na época do estudo, Montor era pesquisador do Instituto de Proteômica na Universidade de Harvard, onde foi concebido e desenvolvido o NAPPA, sob supervisão do professor Joshua LaBaer.

Montor, que foi para os Estados Unidos em 2005, voltou recentemente ao Brasil, onde atualmente é professor do Departamento de Ciências Fisiológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo.

Bactéria sem inimigos

A bactéria Pseudomonas aeruginosa é responsável por sérias infecções, principalmente em indivíduos com mecanismos de defesa comprometidos - como pacientes com Aids ou com fibrose cística.

Além de métodos microbiológicos tradicionais, a infecção pode ser também identificada pelo surgimento de resposta a alguns antígenos. Embora algumas proteínas imunogênicas sejam conhecidas, ainda não há vacina eficiente disponível contra a bactéria.

"Muitas das proteínas já isoladas de Pseudomonas aeruginosa, assim como de outros microrganismos, haviam sido estudadas e há artigos científicos sobre cada uma delas. Mas nem sempre os estudos foram feitos por métodos semelhantes, o que permitiria comparações entre os trabalhos. A grande vantagem do uso de NAPPA é que ele fornece um padrão comparativo e permite identificar quais, entre milhares de proteínas, têm potencial para induzir imunidade em humanos", disse Montor.

Proteínas sob demanda

Segundo o estudo, diferentemente do método tradicional para produção de microarrays de proteína, no NAPPA o DNA complementar (cDNA) - que codifica as proteínas - é clonado em vetor de expressão e imobilizado no array.

Dessa forma, as proteínas de interesse são produzidas apenas no momento do experimento, utilizando-se um sistema de expressão in vitro, como lisado de reticulócito de coelho. Essa abordagem facilita a expressão e descarta a necessidade de purificação de qualquer proteína, as quais são imobilizadas com a ajuda de anticorpos de captura.

Montor explica que, para estudar as proteínas in vitro, sem o uso de NAPPA, seria preciso purificar cada uma delas e depois ligá-las à superfície do array, para se poder fazer um teste de triagem com soro, por exemplo. O método de array de proteínas é um dos mais utilizados na busca de proteínas que geram resposta imune adaptativa.

"Mas produzir milhares de proteínas de um agente patogênico pelo sistema clássico é bastante complicado. Em geral, 25% delas são perdidas no processo de purificação, em especial no caso das proteínas de membranas, que são de difícil purificação", afirmou.

Com a nova plataforma, em vez de produzir as proteínas no sistema in vitro e imobilizá-las em uma matriz, é possível imobilizar na matriz os clones de expressão, muito mais estáveis. Com isso, consegue-se uma matriz que pode ser armazenada em temperatura ambiente. Os clones são expressos em sua superfície e os cientistas podem estudá-los de acordo com o interesse.

Bioinformática

"Utilizamos vários métodos de bioinformática para selecionar 262 proteínas de membrana entre as cerca de 5,6 mil proteínas da Pseudomonas aeruginosa, já que as proteínas de membrana são as mais interessantes para desenvolvimento de vacinas e métodos de diagnóstico, pois em teoria espera-se que sejam as primeiras a serem vistas pelo hospedeiro no momento da infecção", disse Montor.

"Essas 262 proteínas foram produzidas na forma de NAPPA. Em nossos estudos, utilizando pacientes portadores de fibrose cística e pacientes controle, sem fibrose cística, porém infectados por Pseudomonas aeruginosa, encontramos 50 proteínas que estimulam a produção de anticorpos, entre as 262", completou.

As 50 proteínas encontradas, segundo ele, são candidatas para produção de vacinas. "Desse conjunto, identificamos 12 que tinham maior interesse por serem comuns à maioria dos pacientes. A partir daí, montamos um teste utilizando de três a cinco dessas proteínas. Trata-se de um teste sorológico que pode auxiliar no diagnóstico precoce da infecção", disse.

Biodefesa

Antes do trabalho sobre a bactéria Pseudomonas aeruginosa, em seu período nos Estados Unidos, Montor participou de pesquisas que utilizaram tecnologias de microarrays de proteínas no estudo do vibrião da cólera (Vibrio cholerae).

Esses trabalhos, que segundo o cientista também tiveram origem no esforço do governo norte-americano contra o bioterrorismo, foram publicados nas revistas PNAS, em 2008, e PLoS Pathogens, em 2009.

"Minha área de atuação sempre foi oncologia molecular, com um enfoque proteômico. Mas quando iniciei o pós-doutorado nessa área, no Instituto de Proteômica de Harvard, o laboratório havia recebido um forte investimento, da ordem de milhões de dólares para estudar o Vibrio cholerae, aplicando a este patógeno suas plataformas inovadoras, originalmente desenvolvidas para buscar anticorpos para diagnósticos e tratamento do câncer, principalmente de mama", contou.

Por conta disso, a nova plataforma - que evita os problemas dos métodos clássicos de arrays de proteínas e era utilizada em pesquisas sobre câncer - chamou a atenção dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH, na sigla em inglês), que assinou contrato com o laboratório a fim de que seu uso fosse aplicado para patógenos de interesse em biodefesa.

"Após o atentado de 11 de setembro, havia a preocupação geral com a possibilidade de grupos terroristas desenvolverem sprays que disseminassem patógenos, como o vibrião colérico, por exemplo, entre a população. Uma lista de patógenos prioritários foi determinada por instituições competentes, como o NIH e o CDC [Centro de Controle de Doenças], e diversos laboratórios receberam investimentos e reorientaram suas pesquisas nessa época", disse,

Vacina conta o cólera

Montor, junto com o grupo de Harvard, clonou os 3,8 mil genes do genoma de Vibrio cholerae e, após a construção dos arrays tipo NAPPA, fez uma varredura do soro de pacientes infectados com o vibrião para buscar anticorpos que gerassem resposta imune adaptativa contra o patógeno.

"Existem várias vacinas contra esse vibrião, mas nenhuma é efetiva. A proteção não dura mais do que dois ou três anos e a reação inflamatória local é significativa, limitando seu uso pela população civil. No intenso trabalho de varredura do proteoma do vibrião com soro de pacientes infectados, não conseguimos até o momento encontrar nenhuma proteína imunodominante, além da já descrita toxina, ao contrário do que prevíamos. Encontramos um conjunto de várias proteínas que dão alguma resposta imune, mas nada muito significativo - sendo provavelmente esse um dos motivos pelos quais os pacientes não respondem bem à vacina", explicou.

Respostas imunes

Com o objetivo de caracterizar os responsáveis pela intensa reação inflamatória local após a aplicação da vacina em teste nos candidatos, em um trabalho paralelo o grupo do qual Montor participava procurou identificar quais das 3,8 mil proteínas eram capazes de ativar resposta imune inata.

Ao contrário da resposta imune adaptativa, a inflamação no local da vacina é uma resposta imune inata, que geralmente se dá a partir da ativação de certos receptores, chamados de TLR (do inglês Toll-like Receptors).

"Precisávamos saber qual proteína era capaz de se ligar a um desses receptores na superfície celular, ativando cascatas pró-inflamatórias. Produzimos in vitro todas as 3,8 mil proteínas do vibrião e testamos uma a uma para saber quais delas ativavam os receptores específicos, utilizando principalmente ensaios de gene repórter em linhagens celulares construídas por engenharia genética especialmente para esse fim. Uma delas, a proteína PSD, nos chamou a atenção e se tornou uma forte candidata a ser o agente causador da inflamação", disse.

"Em seguida, fizemos testes em animais e, quando a PSD era utilizada como adjuvante, a produção de anticorpos contra proteínas comumente inertes, como albumina, era brutal. Com isso, não apenas descobrimos que a PSD era uma das principais responsáveis pela inflamação local, mas caracterizamos sua via de atuação, por meio do receptor TLR4 e encontramos um adjuvante bastante interessante, que pode ser utilizado em vacinas contra qualquer outro patógeno", completou.